產(chǎn)品類別
- 洛科儀器|臺(tái)灣洛科Rocker真空泵
- 無油式真空泵
- 耐腐蝕真空泵|隔膜泵
- 旋片式油泵
- PTFE鍍膜耐腐蝕真空泵
- 無油正壓泵/空壓機(jī)
- 隔膜式抽水真空泵
- 真空控制器/真空控制系統(tǒng)
- 廢液抽吸系統(tǒng)/真空吸液泵
- 多聯(lián)換膜過來器|三六聯(lián)真空過濾系統(tǒng)
- 三六聯(lián)過濾座|漏斗支架
- 實(shí)驗(yàn)室真空過濾系統(tǒng)|抽濾裝置
- 過濾瓶組|溶劑過濾器
- 流動(dòng)相溶劑抽濾裝置
- 過濾漏斗|過濾器
- 自動(dòng)切向流過濾系統(tǒng)
- 直排水真空過濾系統(tǒng)
- 真空純化裝置/質(zhì)粒提取
- 菌落計(jì)數(shù)器
- 電子點(diǎn)火本生燈
- 電子式高溫滅菌器|紅外滅菌器
- 96孔板注液/清洗裝置
- 恒溫干浴器
- COD分解爐|COD檢測(cè)儀
- 超聲波清洗機(jī)
- 折度計(jì)
- 可攜式水質(zhì)監(jiān)測(cè)儀器
- 石墨加熱板
- 過濾設(shè)備配件
- 蠕動(dòng)泵
- 真空濃縮儀
- 真空干燥器
- 磁力攪拌器
- 其它產(chǎn)品
品牌導(dǎo)航
最新消息-News
藥典微生物限度檢查法
藥典微生物限度檢查法
中國(guó)藥典微生物限度檢查法，為《中國(guó)藥典》附錄收載的關(guān)于藥品微生物檢查的法定方法。檢查項(xiàng)目包括細(xì)菌數(shù)、霉菌數(shù)、酵母菌數(shù)及控制菌檢查。
相關(guān)介紹
《中華人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）微生物限度檢查法為《中國(guó)藥典》附錄收載的關(guān)于藥品微生物檢查的法定方法?！吨袊?guó)藥典》微生物限度檢查法系檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法。檢查項(xiàng)目包括細(xì)菌數(shù)、霉菌數(shù)、酵母菌數(shù)及控制菌檢查?！吨袊?guó)藥典》2010版一部、二部、三部附錄的微生物限度檢查法相同?！吨袊?guó)藥典》2010版第一增補(bǔ)本附錄對(duì)此方法無修改，第二、第三增補(bǔ)本對(duì)此方法有修改，中國(guó)藥典委員會(huì)尚未正式發(fā)布。
任何違反《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》（GMP）或有未經(jīng)批準(zhǔn)添加物質(zhì)所生產(chǎn)的藥品，即使符合《中國(guó)藥典》或按照《中國(guó)藥典》沒有檢出其添加物質(zhì)或相關(guān)物質(zhì)，亦不能認(rèn)為其符合規(guī)定。
《中國(guó)藥典》2010版一部、二部、三部附錄的微生物限度檢查法內(nèi)容無差別，故此文方法，以《中國(guó)藥典》2010版二部附錄ⅪJ為例。
微生物限度檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度10000 級(jí)下的局部潔凈度100 級(jí)的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。檢驗(yàn)全過程必須嚴(yán)格遵守無菌操作，防止再污染。單向流空氣區(qū)域、工作臺(tái)面及環(huán)境應(yīng)定期按《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測(cè)試方法》的現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行潔凈度驗(yàn)證。
供試品檢查時(shí)，如果使用了表面活性劑、中和劑或滅活劑，應(yīng)證明其有效性及對(duì)微生物無毒性。
除另有規(guī)定外，本檢查法中細(xì)菌及控制菌培養(yǎng)溫度為30℃～35℃；霉菌、酵母菌培養(yǎng)溫度為23℃～28℃。
檢驗(yàn)結(jié)果以1g、1ml、10g、10ml、10c㎡ 為單位報(bào)告，特殊品種可以最小包裝單位報(bào)告。
注：《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測(cè)試方法》的現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)分為
GB/T16292-2010 醫(yī)藥工業(yè)潔凈室(區(qū))懸浮粒子的測(cè)試方法
GB/T16293-2010 醫(yī)藥工業(yè)潔凈室(區(qū))浮游菌的測(cè)試方法
GB/T16294-2010 醫(yī)藥工業(yè)潔凈室(區(qū))沉降菌的測(cè)試方法
檢驗(yàn)量
檢驗(yàn)量即一次試驗(yàn)所用的供試品量（g、ml或cm2）。
除另有規(guī)定外，一般供試品的檢驗(yàn)量為10g或10ml；膜劑為100cm2；貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗(yàn)量可以酌減。要求檢查沙門菌的供試品，其檢驗(yàn)量應(yīng)增加20g或20ml（其中10g或10ml用于陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)）。
檢驗(yàn)時(shí),應(yīng)從2個(gè)以上最小包裝單位中抽取供試品，膜劑還不得少于4片。
一般應(yīng)隨機(jī)抽取不少于檢驗(yàn)用量（兩個(gè)以上最小包裝單位）的3倍最供試品。
供試液的制備
根據(jù)供試品的理化特性與生物學(xué)特性，采取適宜的方法制備供試液。供試液制備若需加溫時(shí)，應(yīng)均勻加熱，且溫度不應(yīng)超過45℃。供試液從制備至加入檢驗(yàn)用培養(yǎng)基，不得超過1小時(shí)。
除另有規(guī)定外，常用的供試液制備方法如下。
1.液體供試品
取供試品10ml，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，混勻，作為1:10的供試液。油劑可加入適量的無菌聚山梨酯80使供試品分散均勻。水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液。
2.固體、半固體或黏稠性供試品
取供試品10g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，用勻漿儀或其他適宜的方法，混勻，作為1:10的供試液。必要時(shí)加適量的無菌聚山梨酯80，并置水浴中適當(dāng)加溫使供試品分散均勻。
3.需用特殊方法制備供試液的供試品
（1）非水溶性供試品
方法1 取供試品5g（或5ml )，加至含溶化的（溫度不超過45℃）5g司盤80、3g單硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80無菌混合物的燒杯中，用無菌玻棒攪拌成團(tuán)后，慢慢加人45 ℃的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，邊加邊攪拌，使供試品充分乳化，作為1:20的供試液。
方法2 取供試品10g，加至含20ml無菌十四烷酸異丙酯（制法見附錄XII A無菌檢查法中供試品的無菌檢查項(xiàng)下）和無菌玻璃珠的適宜容器中．必要時(shí)可增加十四烷酸異丙酯的用量，充分振搖，使供試品溶解。然后加入45 ℃的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml，振搖5～10分鐘，萃取，靜置使油水明顯分層，取其水層作為1:10的供試液。
（2）膜劑供試品
取供試品100cm2，剪碎，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml（必要時(shí)可增加稀釋液），浸泡，振搖，作為1:10的供試液。
（3）腸溶及結(jié)腸溶制劑供試品
取供試品10g，加pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液（用于腸溶制劑）或pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液（用于結(jié)腸溶制劑）至100ml，置45 ℃水浴中，振搖，使溶解，作為1 :10的供試液。
（4）氣霧劑、噴霧劑供試品
取規(guī)定量供試品，置冰凍室冷凍約1小時(shí)，取出，迅速消毒供試品開啟部位，用無菌鋼錐在該部位鉆一小孔，放至室溫，并輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)容器，使拋射劑緩緩全部釋出。用無菌注射器吸出全部藥液，加至適量的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（若含非水溶性成分，加適覺的無菌聚山梨酯80）中，混勻，取相當(dāng)于10g或10ml的供試品，再稀釋成1:10的供試液。
（5）貼劑供試品
取規(guī)定量供試品，去掉貼劑的保護(hù)層，放置在無菌玻璃或塑料片上，粘貼面朝上。用適宜的無菌多孔材料（如無菌紗布）覆蓋貼劑的粘貼面，以避免貼劑粘貼在一起。然后將其置于適宜體積并含有表面活性劑（如聚山梨酯80或卵磷脂）的稀釋劑中，用力振蕩至少30分鐘，制成供試液。貼劑也可采用其他適宜的方法制備成供試液。
（6）具抑菌活性的供試品
當(dāng)供試品有抑菌活性時(shí)，采用下列方法進(jìn)行處理，以消除供試液的抑菌活性，再依法檢查。常用的方法如下。
①培養(yǎng)基稀釋法取規(guī)定量的供試液，至較大量的培養(yǎng)基中，使單位體積內(nèi)的供試品含量減少，至不含抑菌作用。測(cè)定細(xì)菌、霉菌及酵母菌的菌數(shù)時(shí)，取同稀釋級(jí)的供試液2ml，每1ml供試液可等量分注多個(gè)平皿，傾注瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，培養(yǎng)，計(jì)數(shù)。每1ml供試液所注的平皿中生長(zhǎng)的菌落數(shù)之和即為1ml的菌落數(shù)，計(jì)算每1ml供試液的平均菌落數(shù)，按平皿法計(jì)數(shù)規(guī)則報(bào)告菌數(shù)；控制菌檢查時(shí)，可加大增菌培養(yǎng)基的用量。
②離心沉淀法取一定量的供試液，500轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，取全部上清液混合。用于細(xì)菌檢查。
③薄膜過濾法見細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)項(xiàng)下的“薄膜過濾法”。
④中和法凡含汞、砷或防腐劑等具有抑菌作用的供試品，可用適宜的中和劑或滅活劑消除其抑菌成分。中和劑或滅活劑可加在所用的稀釋液或培養(yǎng)基中。
計(jì)數(shù)
適用性檢查
細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)用的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基的適用性檢查，成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)檢查。
菌種
試驗(yàn)用菌株的傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保藏中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保存，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。
大腸埃希菌（Escherichia coli[CMCC ( B ) 44l02]
金黃色葡萄球菌（StapHylococcus aureus）[ CMCC ( B ) 26003 ]
枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis ) [ CMCC ( B ) 63501 ]
白色念珠菌（Candida albicans）〔CMCC ( F ) 98001〕
黑曲霉（Aspergillus niger) [ CMCC ( F ) 98003 ]
菌液制備
接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中或營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)18～24小時(shí)；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24～48小時(shí)。上述培養(yǎng)物用0 . 9%無菌氯化鈉溶液制成每lml含菌數(shù)為50～100cfu的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)5～7天，加人3～5ml含0.05 % ( ml /ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05 % ( ml / ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每lml含孢子數(shù)50～100cfu的孢子懸液。
菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用；若保存在2～8 ℃，可在24小時(shí)內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在2～8 ℃，在驗(yàn)證過的貯存期內(nèi)使用。
適用性檢查
取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌各50～100cfu，分別注入無菌平皿中，立即傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，混勻，凝固，置30～35 ℃培養(yǎng)48小時(shí)，計(jì)數(shù)；取白色念珠菌、黑曲霉各50～100cfu，分別注入無菌平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，混勻，凝固，置23～28 ℃培養(yǎng)72小時(shí)，計(jì)數(shù)；取白色念珠菌50～100cfu，注入無菌平皿中，立即傾注酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基．平行制備2個(gè)平皿，混勻，凝固，置23～28 ℃培養(yǎng)72小時(shí)，計(jì)數(shù)。同時(shí)，用相應(yīng)的對(duì)照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗(yàn)。
結(jié)果判定
若被檢培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)不小于對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的70 %，且菌落形態(tài)大小與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落一致，判該培養(yǎng)基的適用性檢查符合規(guī)定。
方法的驗(yàn)證
當(dāng)建立產(chǎn)品的微生物限度檢查法時(shí)，應(yīng)進(jìn)行細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證，以確認(rèn)所采用的方法適合于該產(chǎn)品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)的測(cè)定。若產(chǎn)品的組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)，計(jì)數(shù)方法應(yīng)重新驗(yàn)證。
驗(yàn)證時(shí)，按供試液的制備和細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)所規(guī)定的方法及下列要求進(jìn)行。對(duì)各試驗(yàn)菌的回收率應(yīng)逐一進(jìn)行驗(yàn)證。
菌種及菌液制備
同計(jì)數(shù)培養(yǎng)鑒的適用性檢查。
驗(yàn)證方法
驗(yàn)證試驗(yàn)至少應(yīng)進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)，并分別計(jì)算各試驗(yàn)菌每次試驗(yàn)的回收率。
( l )試驗(yàn)組平皿法計(jì)數(shù)時(shí)，取試驗(yàn)可能用的最低稀釋級(jí)供試液lml和50～100cfu試驗(yàn)菌，分別注人平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定其菌數(shù)。薄膜過濾法計(jì)數(shù)時(shí)，取規(guī)定量試驗(yàn)可能用的最低稀釋級(jí)供試液，過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加人50～100cfu試驗(yàn)菌，過濾，按薄膜過濾法測(cè)定其菌數(shù)。
( 2 )菌液組測(cè)定所加的試驗(yàn)菌數(shù)。
( 3 )供試品對(duì)照組取規(guī)定量供試液，按菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定供試品本底菌數(shù)。
( 4 )稀釋劑對(duì)照組若供試液制備需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過濾等特殊處理時(shí)，應(yīng)增加稀釋劑對(duì)照組，以考察供試液制備過程中微生物受影響的程度。試驗(yàn)時(shí)，可用相應(yīng)的稀釋液替代供試品，加入試驗(yàn)菌，使最終菌濃度為每lml供試液含50～100cfu，按試驗(yàn)組的供試液制備方法和菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定其菌數(shù)。
結(jié)果判斷
在3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中，稀釋劑對(duì)照組的菌數(shù)回收率（稀釋劑對(duì)照組的平均菌落數(shù)占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率）應(yīng)均不低于70 %。若試驗(yàn)組的菌數(shù)回收率（試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組的平均菌落數(shù)的值占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率）均不低于70%，照該供試液制備方法和計(jì)數(shù)法測(cè)定供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)；若任一次試驗(yàn)中試驗(yàn)組的菌數(shù)回收率低于70 %，應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀法、薄膜過濾法、中和法（常見干擾物的中和劑或滅活方法見表1）等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法驗(yàn)證。
表l 常見干擾物的中和劑或滅活方法
|
干擾物 |
可選用的中和劑或滅活方法 |
|
酚類、乙醇、吸附物 |
稀釋法 |
|
稀釋法、甘氨酸、硫代硫酸鹽 |
|
|
季銨類化合物（QACs）、對(duì)羥基苯甲酸酯 |
|
|
汞類制劑 |
|
|
雙胍類化合物 |
|
|
聚山梨酯 |
|
|
硫代硫酸鹽 |
|
|
乙二胺四乙酸（EDTA ) |
鎂或鈣離子 |
|
β-內(nèi)酰胺酶 |
若沒有適宜的方法消除供試品的抑菌活性，那么驗(yàn)證試驗(yàn)中微生物回收的失敗可看成是因供試品的抗菌活性引起的，同時(shí)表明該供試品不能被試驗(yàn)菌污染。但是，供試品也可能僅對(duì)試驗(yàn)用菌株具有抑制作用，而對(duì)其他菌株沒有抑制作用。因此，根據(jù)供試品須符合的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)和菌數(shù)報(bào)告規(guī)則，在不影響檢驗(yàn)結(jié)果判斷的前提下，應(yīng)采用能使微生物生長(zhǎng)的更高稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行方法驗(yàn)證試驗(yàn)。若驗(yàn)證試驗(yàn)符合要求，應(yīng)以該稀釋級(jí)供試液作為最低稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行供試品檢驗(yàn)。
計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證時(shí)，采用上述方法若還存在一株或多株試驗(yàn)菌的回收率達(dá)不到要求，那么選擇回收率最接近要求的方法和試驗(yàn)條件進(jìn)行供試品的檢驗(yàn)。
驗(yàn)證試驗(yàn)也可與供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)同時(shí)進(jìn)行。
供試品檢查
計(jì)數(shù)方法包括平皿法和薄膜過濾法。檢查時(shí)，按已驗(yàn)證的計(jì)數(shù)方法進(jìn)行供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌菌數(shù)的測(cè)定。
按計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證試驗(yàn)確認(rèn)的程序進(jìn)行供試液制備。用稀釋液稀釋成1:10、1:l02、l:103等稀釋級(jí)的供試液。
平皿法
根據(jù)菌數(shù)報(bào)告規(guī)則取相應(yīng)稀釋級(jí)的供試液1ml，置直徑90mm的無菌平皿中，注人15～20ml溫度不超過45 ℃的溶化的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。每稀釋級(jí)每種培養(yǎng)基至少制備2個(gè)平板。
陰性對(duì)照試驗(yàn)
取試驗(yàn)用的稀釋液1ml，置無菌平皿中．注入培養(yǎng)基，凝固，倒置培養(yǎng)。每種計(jì)數(shù)用的培養(yǎng)基各制備2個(gè)平板，均不得有菌生長(zhǎng)。
培養(yǎng)和計(jì)數(shù)
除另有規(guī)定外，細(xì)菌培養(yǎng)3天，霉菌、酵母菌培養(yǎng)5天，逐日觀察菌落生長(zhǎng)情況，點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)，必要時(shí)，可適當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至7天進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)并報(bào)告。菌落蔓延生長(zhǎng)成片的平板不宜計(jì)數(shù)。點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)后，計(jì)算各稀釋級(jí)供試液的平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報(bào)告規(guī)則報(bào)告菌數(shù)。若同稀釋級(jí)兩個(gè)平板的菌落平均數(shù)不小于15．則兩個(gè)平板的菌落數(shù)不能相差l倍或以上。
一般營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用于細(xì)菌計(jì)數(shù)；玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基用于霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)；酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基用于酵母菌計(jì)數(shù)。在特殊情況下．若營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)有霉菌和酵母菌、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)有細(xì)菌，則應(yīng)分別點(diǎn)計(jì)霉菌和酵母菌、細(xì)菌菌落數(shù)。然后將營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的霉菌和酵母菌數(shù)或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上的細(xì)菌數(shù)，與玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基中的霉菌和酵母菌數(shù)或營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中的細(xì)菌數(shù)進(jìn)行比較，以菌落數(shù)高的培養(yǎng)基中的菌數(shù)為計(jì)數(shù)結(jié)果。
含蜂蜜、王漿的液體制劑，用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基測(cè)定霉菌數(shù)，用酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基測(cè)定酵母菌數(shù)，合并計(jì)數(shù)。
菌數(shù)報(bào)告規(guī)則
細(xì)菌、酵母菌宜選取平均菌落數(shù)小于300cfu、霉菌宜選取平均菌落數(shù)小于100cfu的稀釋級(jí)，作為菌數(shù)報(bào)告（取兩位有效數(shù)字）的依據(jù)。以最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告1g、lml或10cm2供試品中所含的菌數(shù)。
如各稀釋級(jí)的平板均無菌落生長(zhǎng)，或僅最低稀釋級(jí)的平板有菌落生長(zhǎng)，但平均菌落數(shù)小于1時(shí)，以<1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。
薄膜過濾法
采用薄膜過濾法，濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45μm，直徑一般為50mm，若采用其他直徑的濾膜．沖洗量應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。選擇濾膜材質(zhì)時(shí)應(yīng)保證供試品及其溶劑不影響微生物的充分被截留。濾器及濾膜使用前應(yīng)采用適宜的方法滅菌。使用時(shí)，應(yīng)保證濾膜在過濾前后的完整性。水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤(rùn)濕濾膜。油類供試品，其濾膜和濾器在使用前應(yīng)充分干燥。為發(fā)揮濾膜的最大過濾效率，應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個(gè)濾膜表面。供試液經(jīng)薄膜過濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量為100ml?？倹_洗量不得超過1000ml.， 以避免濾膜上的微生物受損傷。
取相當(dāng)于每張濾膜含lg、lml或10cm2供試品的供試液，加至適量的稀釋劑中，混勻，過濾。若供試品每1g、lml或10cm2所含的菌數(shù)較多時(shí)，可取適宜稀釋級(jí)的供試液lml進(jìn)行試驗(yàn)。用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或其他適宜的沖洗液沖洗濾膜，沖洗方法和沖洗量同“計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證”。沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。
陰性對(duì)照試驗(yàn)
取試驗(yàn)用的稀釋液lml，照上述薄膜過濾法操作，作為陰性對(duì)照。陰性對(duì)照不得有菌生長(zhǎng)。
培養(yǎng)和計(jì)數(shù)
培養(yǎng)條件和計(jì)數(shù)方法同平皿法，每片濾膜上的菌落數(shù)應(yīng)不超過100cfu。
菌數(shù)報(bào)告規(guī)則
以相當(dāng)于1g、lml或10cm2供試品的菌落數(shù)報(bào)告菌數(shù)；若濾膜上無菌落生長(zhǎng)，以<1報(bào)告菌數(shù)（每張濾膜過濾1g、lml或10cm2供試品），或
控制菌檢查
適用性檢查
控制菌檢查用的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基的適用性檢查，成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)檢查。
菌種
對(duì)試驗(yàn)菌種的要求同計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查。
大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC ( B ) 44l02]
金黃色葡萄球菌（StapHylococcus aureus）[ CMCC ( B ) 26003 ]
乙型副傷寒沙門菌（Salmonella paratypHi B )〔CMCC ( B ) 50094〕
銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）〔CMCC ( B ) 10104〕
生孢梭菌（Clostridium sporogenes ) [ CMCC ( B ) 6494l]
白色念珠菌（Candida albicans）〔CMCC ( F ) 98001〕
菌液制備
接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中或營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24小時(shí)；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24～48小時(shí)。用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每lml含菌數(shù)為10～100cfu的菌懸液。
菌懸液在室溫下放置應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用．若保存在2～8 ℃可在24小時(shí)內(nèi)使用。
適用性檢查
控制菌檢查用培養(yǎng)基的適用性檢查項(xiàng)目包括促生長(zhǎng)能力、抑制能力及指示能力的檢查。各培養(yǎng)基的檢測(cè)項(xiàng)目及所用菌株見表2。
表2 控制菌檢查用培養(yǎng)基的促生長(zhǎng)能力、抑制能力及指示能力檢查
|
控制菌檢查 |
培養(yǎng)基 |
特性 |
試驗(yàn)菌株 |
|
大腸埃希菌 |
促生長(zhǎng)能力 |
大腸埃希菌 |
|
|
|
抑制能力 |
||
|
4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養(yǎng)基 |
促生長(zhǎng)能力+指示能力 |
大腸埃希菌 |
|
|
促生長(zhǎng)能力+指示能力 |
大腸埃希菌 |
||
|
促生長(zhǎng)能力 |
大腸埃希菌 |
||
|
|
抑制能力 |
||
|
促生長(zhǎng)能力+指示能力 |
大腸埃希菌 |
||
|
促生長(zhǎng)能力+指示能力 |
大腸埃希菌 |
||
|
營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 |
促生長(zhǎng)能力 |
乙型副傷寒沙門菌 |
|
|
四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基 |
促生長(zhǎng)能力 |
乙型副傷寒沙門菌 |
|
|
|
抑制能力 |
||
|
促生長(zhǎng)能力+指示能力 |
|||
|
促生長(zhǎng)能力+指示能力 |
|||
|
三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基 |
指示能力 |
乙型副傷寒沙門菌 |
|
|
促生長(zhǎng)能力 |
銅綠假單胞菌 |
||
|
|
抑制能力 |
||
|
溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基 |
促生長(zhǎng)能力 |
||
|
|
抑制能力 |
大腸埃希菌 |
|
|
綠膿菌素測(cè)定用培養(yǎng)基 |
促生長(zhǎng)能力+指示能力 |
||
|
亞碲酸鹽肉湯培養(yǎng)基 |
促生長(zhǎng)能力 |
||
|
|
抑制能力 |
大腸埃希菌 |
|
|
促生長(zhǎng)能力 |
|||
|
|
抑制能力 |
大腸埃希菌 |
|
|
梭菌 |
促生長(zhǎng)能力 |
||
|
哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基 |
促生長(zhǎng)能力 |
生孢梭菌 |
|
|
沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基 |
促生長(zhǎng)能力 |
白色念珠菌 |
|
|
沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 |
促生長(zhǎng)能力+指示能力 |
||
|
促生長(zhǎng)能力+指示能力 |
|||
|
|
抑制能力 |
大腸埃希菌 |
|
|
促生長(zhǎng)能力+指示能力 |
液體培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力檢查
分別接種不大于100cfu的試驗(yàn)菌（表2） 于被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基中，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及最短培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)。與對(duì)照培養(yǎng)基管比較，被檢培養(yǎng)基管試驗(yàn)菌應(yīng)生長(zhǎng)良好。
固體培養(yǎng)墓促生長(zhǎng)能力檢查
取試驗(yàn)菌各0.1ml（含菌數(shù)50～100cfu）分別涂布于被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基平板上，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及最短培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)。被檢培養(yǎng)基與對(duì)照培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落大小、形態(tài)特征應(yīng)一致。
培養(yǎng)基抑制能力檢查
接種不少于100cfu的試驗(yàn)菌（表2）于被檢培養(yǎng)基中，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及最長(zhǎng)時(shí)間下培養(yǎng)，試驗(yàn)菌應(yīng)不得生長(zhǎng)。
固體培養(yǎng)基指示能力檢查
取試驗(yàn)菌各0.1ml（含菌數(shù)不大于100cfu )（表2）分別涂布于被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基平板上，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及時(shí)間下培養(yǎng)。被檢培養(yǎng)基上試驗(yàn)菌生長(zhǎng)的菌落大小、形態(tài)特征、指示劑反應(yīng)情況等應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基一致。
液體培養(yǎng)基指示能力檢查
分別接種不大于100cfu的試驗(yàn)菌（表2）于被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基中，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及最短培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)。與對(duì)照培養(yǎng)基管比較，被檢培養(yǎng)基管試驗(yàn)菌生長(zhǎng)情況、指示劑反應(yīng)等應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基一致。
驗(yàn)證
當(dāng)建立產(chǎn)品的微生物限度檢查法時(shí)，應(yīng)進(jìn)行控制菌檢查方法的驗(yàn)證，以確認(rèn)所采用的方法適合于該產(chǎn)品的控制菌檢查。若產(chǎn)品的組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)，檢查方法應(yīng)重新驗(yàn)證。
驗(yàn)證時(shí)，依各品種項(xiàng)下微生物限度標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定檢查的控制菌選擇相應(yīng)驗(yàn)證的菌株，驗(yàn)證大腸菌群檢查法時(shí)，采用大腸埃希菌作為驗(yàn)證菌株。驗(yàn)證試驗(yàn)按供試液的制備和控制菌檢查法的規(guī)定及下列要求進(jìn)行。
菌種及菌液制備
同控制菌檢查用培養(yǎng)基的適用性檢查。
驗(yàn)證方法
取規(guī)定量供試液及10～100cfu試驗(yàn)菌加入增菌培養(yǎng)基中，依相應(yīng)控制菌檢查法進(jìn)行檢查。當(dāng)采用薄膜過濾法時(shí)．取規(guī)定量供試液，過濾，沖洗，試驗(yàn)菌應(yīng)加在最后一次沖洗液中，過濾后，注入增菌培養(yǎng)荃或取出濾膜接人增菌培養(yǎng)基中。
結(jié)果判斷
若上述試驗(yàn)檢出試驗(yàn)菌，按此供試液制備法和控制菌檢查法進(jìn)行供試品的該控制菌檢查；若未檢出試驗(yàn)菌，應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法驗(yàn)證。
驗(yàn)證試驗(yàn)也可與供試品的控制菌檢查同時(shí)進(jìn)行。
供試品檢查
供試品的控制菌檢查應(yīng)按已驗(yàn)證的方法進(jìn)行。
陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)
陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)方法同供試品的控制菌檢查，對(duì)照菌的加菌量為10～10Ocfu。陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)檢出相應(yīng)的控制菌。
陰性對(duì)照試驗(yàn)
取稀釋液10ml照相應(yīng)控制菌檢查法檢查，作為陰性對(duì)照。陰性對(duì)照應(yīng)無菌生長(zhǎng)，
（1）大腸埃希菌（Escherichia coli）取供試液10ml（相當(dāng)于供試品lg、lml、10cm2)，直接或處理后接種至適量（不少于100ml）的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24小時(shí)，必要時(shí)可延長(zhǎng)至48小時(shí)。
取上述培養(yǎng)物0.2ml，接種至含5ml MUG培養(yǎng)基的試管內(nèi)，培養(yǎng)，于5小時(shí)、24小時(shí)在366nm紫外光下觀察，同時(shí)用未接種的MUG培養(yǎng)基作本底對(duì)照。若管內(nèi)培養(yǎng)物呈現(xiàn)熒光，為MUG陽(yáng)性；不呈現(xiàn)熒光，為MUG陰性。觀察后，沿培養(yǎng)管的管壁加人數(shù)滴靛基質(zhì)試液，液面呈玫瑰紅色，為靛基質(zhì)陽(yáng)性；呈試劑本色，為靛基質(zhì)陰性。本底對(duì)照應(yīng)為MUG陰性和靛基質(zhì)陰性。
如MUG陽(yáng)性、靛基質(zhì)陽(yáng)性，判供試品檢出大腸埃希菌；如MUG陰性、靛基質(zhì)陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌；如MUG陽(yáng)性、靛基質(zhì)陰性，或MUG陰性、靛基質(zhì)陽(yáng)性，則應(yīng)取膽鹽乳糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)物劃線接種于曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)18～24小時(shí)。
若平板上無菌落生長(zhǎng)或生長(zhǎng)的菌落與表3所列的菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出大腸埃希菌。若平板上生長(zhǎng)的菌落與表3所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似，應(yīng)進(jìn)行分離、純化、染色鏡檢和適宜的鑒定試驗(yàn)，確認(rèn)是否為大腸埃希菌。
表3 大腸埃希菌菌落形態(tài)特征
|
培養(yǎng)基 |
菌落形態(tài) |
|
紫黑色、淺紫色、藍(lán)紫色或粉紅色，菌落中心呈深紫色或無明顯暗色中心，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤(rùn)，常有金屬光澤 |
|
|
麥康凱瓊脂 |
鮮桃紅色或微紅色，菌落中心呈深桃紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，濕潤(rùn) |
（2）大腸菌群（Coliform）取含適量（不少于10ml )的乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基管3支，分別加入1 :10的供試液lml（含供試品0.1g或0.1ml）、1: 100的供試液1ml（含供試品0.01g或0.01ml）、1:1000的供試液1 ml（含供試品0.001g或0.001ml），另取1支乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基管加人稀釋液1ml作為陰性對(duì)照管。培養(yǎng)18～24小時(shí)。
乳糖膽鹽發(fā)酵管若無菌生長(zhǎng)或有菌生長(zhǎng)但不產(chǎn)酸產(chǎn)氣，判該管未檢出大腸菌群；若產(chǎn)酸產(chǎn)氣，應(yīng)將發(fā)酵管中的培養(yǎng)物分別劃線接種于曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)墓的平板上，培養(yǎng)18～24小時(shí)。
若平板上無菌落生長(zhǎng)，或生長(zhǎng)的菌落與表4所列的菌落形態(tài)特征不符或?yàn)榉歉锾m氏陰性無芽抱桿菌，判該管未檢出大腸菌群；若平板上生長(zhǎng)的菌落與表4所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似，且為革蘭氏陰性無芽抱桿菌，應(yīng)進(jìn)行確證試驗(yàn)。
表4 大腸菌群菌落形態(tài)特征
|
培養(yǎng)基 |
菌落形態(tài) |
|
紫黑色、紫紅色、紅色或粉紅色，圓形，扁平或稍凸起，邊緣整齊．表面光滑，濕潤(rùn) |
|
|
麥康凱瓊脂 |
鮮桃紅色或粉紅色，圓形，扁平或稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤(rùn) |
確證試驗(yàn)從上述分離平板上挑選4～5個(gè)疑似菌落，分別接種于乳糖發(fā)酵管中，培養(yǎng)24～48小時(shí)。若產(chǎn)酸產(chǎn)氣，判該乳糖膽鹽發(fā)醉管檢出大腸菌群，否則判未檢出大腸菌群。
根據(jù)大腸菌群的檢出管數(shù)，按表5報(bào)告lg或lml供試品中的大腸菌群數(shù)。
表5 可能的大腸菌群數(shù)
|
各供試品量的檢出結(jié)果 |
可能的大腸菌群數(shù)N（個(gè)/g或ml ) |
||
|
0.1g或0.1ml |
0.01g或0.01ml |
0.01g或0.01ml |
|
|
+ |
+ |
+ |
> 103 |
|
+ |
+ |
|
102< N < 103 |
|
+ |
― |
― |
10 < N < 102 |
|
― |
― |
― |
< 10 |
注：+代表檢出大腸菌群；―代表未檢出大腸菌群．
（3）沙門菌（salmonella）取供試品10g或10ml ,直接或處理后接種至適量（不少于200ml）的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，用勻漿儀或其他適宜方法混勻，培養(yǎng)18～24小時(shí)。
取上述培養(yǎng)物1ml，接種于10 ml四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24小時(shí)后，分別劃線接種于膽鹽硫乳瓊脂（或沙門、志賀菌屬瓊脂）培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂（或曙紅亞甲藍(lán)瓊脂）培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)18～24小時(shí)（必要時(shí)延長(zhǎng)至40～48小時(shí)）。若平板上無菌落生長(zhǎng)或生長(zhǎng)的菌落不同于表6所列的特征，判供試品未檢出沙門菌。
若平板上生長(zhǎng)的菌落與表6所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似，用接種針挑選2～3個(gè)菌落分別于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面上進(jìn)行斜面和高層穿刺接種，培養(yǎng)18～24小時(shí)，如斜面未見紅色、底層未見黃色；或斜面黃色、底層無黑色，判供試品未檢出沙門菌。否則，應(yīng)取三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基斜面的培養(yǎng)物進(jìn)行適宜的鑒定試驗(yàn)，確認(rèn)是否為沙門菌。
表6 沙門菌菌落形態(tài)特征
|
培養(yǎng)基 |
菌落形態(tài) |
|
無色至淺橙色，半透明，菌落中心帶黑色或全部黑色或無黑色 |
|
|
沙門、志賀菌屬瓊脂 |
無色至淡紅色，半透明或不透明，菌落中心有時(shí)帶黑褐色 |
|
無色至淺橙色．透明或半透明，光滑濕潤(rùn)的圓形菌落 |
|
|
麥康凱瓊脂 |
無色至淺橙色，透明或半透明，菌落中心有時(shí)為暗色 |
（4）銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）取供試液10ml（相當(dāng)于供試品1g、lml、10cm2)，直接或處理后接種至適量（不少于100ml）的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24小時(shí)。取上述培養(yǎng)物，劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)18～24小時(shí)。
銅綠假單胞菌典型菌落呈扁平、無定形、周邊擴(kuò)散、表面濕潤(rùn)，灰白色，周圍時(shí)有藍(lán)綠色素?cái)U(kuò)散。如平板上無菌落生長(zhǎng)或生長(zhǎng)的菌落與上述菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出銅綠假單胞菌。如平板生長(zhǎng)的菌落與上述菌落形態(tài)特征相符或疑似，應(yīng)挑選2～3個(gè)菌落，分別接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)18～24小時(shí)。取斜面培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢及氧化酶試驗(yàn)。
氧化酶試驗(yàn)
取潔凈濾紙片置于平皿內(nèi)，用無菌玻棒取斜面培養(yǎng)物涂于濾紙片上，滴加新配制的1%二鹽酸二甲基對(duì)苯二胺試液，在30秒內(nèi)若培養(yǎng)物呈粉紅色并逐漸變?yōu)樽霞t色為氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性，否則為陰性。
若斜面培養(yǎng)物為非革蘭氏陰性無芽抱桿菌或氧化酶試驗(yàn)陰性，均判供試品未檢出銅綠假單胞菌。否則，應(yīng)進(jìn)行綠膿菌素試驗(yàn)。
綠膿菌素（Pyocyanin）試驗(yàn)
取斜面培養(yǎng)物接種于PDP瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)24小時(shí)，加三氯甲烷3～5ml至培養(yǎng)管中，攪碎培養(yǎng)基并充分振搖。靜置片刻，將三氯甲烷相移至另一試管中，加人lmol / L鹽酸試液約lml，振搖后，靜置片刻，觀察。若鹽酸溶液呈粉紅色，為綠膿菌素試驗(yàn)陽(yáng)性，否則為陰性。同時(shí)用未接種的PDP瓊脂培養(yǎng)基斜面同法作陰性對(duì)照，陰性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)呈陰性。
若上述疑似菌為革蘭氏陰性桿菌、氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性及綠膿菌素試驗(yàn)陽(yáng)性，判供試品槍出銅綠假單胞菌。若上述疑似菌為革蘭陰性桿菌、氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性及綠膿菌素試驗(yàn)陰性，應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行適宜的鑒定試驗(yàn)，確認(rèn)是否為銅綠假單胞菌。
( 5 )金黃色葡萄球菌（StapHylococcus aureus）取供試液l0ml（相當(dāng)于供試品1g、lml、l0cm2)，直接或處理后接種至適見（不少于100ml）的亞碲酸鈉（鉀）肉湯（或營(yíng)養(yǎng)肉湯）培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24小時(shí)，必要時(shí)可延長(zhǎng)至48小時(shí)。取上述培養(yǎng)物，劃線接種于卵黃氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基或甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)24～72小時(shí)。若平板上無菌落生長(zhǎng)或生長(zhǎng)的菌落不同于表7所列特征，判供試品未檢出金黃色葡萄球菌。
表7 金黃色葡萄球菌菌落形態(tài)特征
|
培養(yǎng)基 |
菌落形態(tài) |
|
金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，外圍有黃色環(huán)，菌落直徑0.7～lmm |
|
|
卵黃氯化鈉瓊脂 |
金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，外圍有卵磷脂分解的乳濁圈，菌落直徑1～2mm |
若平板上生長(zhǎng)的菌落與表7所列的菌落特征相符或疑似，應(yīng)挑選2～3個(gè)菌落，分別接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)18～24小時(shí)。取營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色．并接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24小時(shí)，做血漿凝固酶試驗(yàn)。
血漿凝固酶試驗(yàn)
取滅菌小試管3支，各加入血漿和無菌水混合液（1 : 1 ) 0.5ml，再分別加入可疑菌株的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物（或由營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物制備的濃菌懸液）0.5ml、金黃色葡萄球菌營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物（或由營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物制備的濃菌懸液）0.5ml、營(yíng)養(yǎng)肉湯或0.9%無菌氯化鈉溶液0.5ml ,即為試驗(yàn)管、陽(yáng)性對(duì)照管和陰性對(duì)照管。將3管同時(shí)培養(yǎng)，3小時(shí)后開始觀察直至24小時(shí)。陰性對(duì)照管的血漿應(yīng)流動(dòng)自如，陽(yáng)性對(duì)照管血漿應(yīng)凝固，若試驗(yàn)管血漿凝固為血漿凝固酶試驗(yàn)陽(yáng)性，否則為陰性。如陽(yáng)性對(duì)照管或陰性對(duì)照管不符合規(guī)定時(shí)，應(yīng)另制備血漿，重新試驗(yàn)。
若上述疑似菌為非革蘭氏陽(yáng)性球菌、血漿凝固酶試驗(yàn)陰性，判供試品未檢出金黃色葡萄球菌。
( 6 )梭菌（Clostridium）取供試液10ml（相當(dāng)于供試品1g、lml、10cm2) 2份，其中l(wèi)份置80 ℃保溫10分鐘后迅速冷卻。上述2份供試液直接或處理后分別接種至100ml的梭菌增菌培養(yǎng)基中。置厭氧條件下培養(yǎng)48小時(shí)。取上述每一培養(yǎng)物0.2ml，分別涂抹接種于含慶大霉素的哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基平板上，置厭氧條件下培養(yǎng)48～72小時(shí)。若平板上無菌落生長(zhǎng)，判供試品未檢出梭菌；若平板上有菌落生長(zhǎng)，應(yīng)挑選2～3個(gè)菌落分別進(jìn)行革蘭氏染色和過氧化氫酶試驗(yàn)。
過氧化氫酶試驗(yàn)
取七述平板上的菌落，置潔凈玻片上，滴加3%過氧化氫試液，若菌落表面有氣泡產(chǎn)生，為過氧化氫酶試驗(yàn)陽(yáng)性，否則為陰性。
若上述可疑菌落為革蘭氏陽(yáng)性梭菌，有或無卵圓形或球形的芽孢，過氧化氫酶試驗(yàn)陰性，判供試品檢出梭菌，否則判供試品未檢出梭菌。
( 7 )白色念珠菌（Candida albicans）取供試液10ml（相當(dāng)于供試品1g、lml、l0cm2）直接或處理后接種至適量（不少于100ml）的沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48～72小時(shí)。取上述培養(yǎng)物劃線接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)24～48小時(shí)（必要時(shí)延長(zhǎng)至72小時(shí)）。
白色念珠菌在沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落呈乳白色，偶見淡黃色，表面光滑有濃酵母氣味，培養(yǎng)時(shí)間稍久則菌落增大，顏色變深、質(zhì)地變硬或有皺褶。若平板上無菌落生長(zhǎng)或生長(zhǎng)的菌落與上述菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出白色念珠菌。如平板上生長(zhǎng)的菌落與上述菌落形態(tài)特征相符或疑似，應(yīng)挑選2～3個(gè)菌落分別接種至念珠菌顯色培養(yǎng)基平板上 ，培養(yǎng)24～48小時(shí)（必要時(shí)延長(zhǎng)至72小時(shí)）。若平板上無綠色或翠綠色的菌落生長(zhǎng)，判供試品未檢出白色念珠菌。
若平板上生長(zhǎng)的菌落為綠色或翠綠色．挑取相符或疑似的菌落接種于1%聚山梨酯80-玉米瓊脂培養(yǎng)基上．培養(yǎng)24～48小時(shí)。取培養(yǎng)物進(jìn)行染色、鏡檢及芽管試驗(yàn)。
芽管試驗(yàn)
挑取l%聚山梨酯80-玉米瓊脂培養(yǎng)基上的培養(yǎng)物，接種于加有一滴血清的載玻片上，蓋上蓋玻片，置濕潤(rùn)的平皿內(nèi)，于35～37 ℃培養(yǎng)1～3小時(shí)，置顯微鏡下觀察孢子上有否長(zhǎng)出短小芽管。
若上述疑似菌為非革蘭氏陽(yáng)性菌，顯微鏡下未見厚膜孢子、假菌絲、芽管，判供試品未檢出白色念珠菌。
結(jié)果判斷
供試品檢出控制菌或其他致病菌時(shí)，按一次檢出結(jié)果為準(zhǔn)，不再?gòu)?fù)試。
供試品的細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)其中任何一項(xiàng)不符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定，應(yīng)從同一批樣品中隨機(jī)抽樣，獨(dú)立復(fù)試兩次，以3次結(jié)果的平均值報(bào)告菌數(shù)。
若供試品的細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)及控制菌三項(xiàng)檢驗(yàn)結(jié)果均符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定，判供試品符合規(guī)定；若其中任何一項(xiàng)不符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定．判供試品不符合規(guī)定。
制備方法
稀釋液
稀釋液配制后，應(yīng)采用驗(yàn)證合格的滅菌程序滅菌。
1 .pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液
照無菌檢查法（附錄XII A）制備。
2.pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液、pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液
按緩沖液（二部附錄XV D）配制后，過濾，分裝，滅菌。
如需要，可在上述稀釋液滅菌前或滅菌后加入表面活性劑或中和劑等。
3.0.9%無菌氯化鈉溶液
取氯化鈉9.0g，加水溶解使成1000ml，過濾，分裝，滅菌。
培養(yǎng)基制備
培養(yǎng)基可按以下處方制備，也可使用按該處方生產(chǎn)的符合要求的脫水培養(yǎng)基。配制后，應(yīng)采用驗(yàn)證合格的滅菌程序滅菌。
1.營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基及改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基
照無菌檢查法（附錄XII A）制備。
2.玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基
胨 5.0g
玫瑰紅鈉 0.0133g
葡萄糖 10.0g
瓊脂 14.0g
磷酸二氫鉀 1.0g
水 1000ml
硫酸鎂 0.5g
除葡萄糖、玫瑰紅鈉外，取上述成分，混合，微溫溶解，濾過，加入葡萄糖、玫瑰紅鈉，分裝．滅菌。
胨 10.0g
瓊脂 14.0g
酵母浸出粉 5.0g
水 1000ml
葡萄糖 20.0g
除葡萄糖外，取上述成分．混合，微溫溶解，濾過，加人葡萄糖，分裝．滅菌。
胨20.0g
磷酸二氫鉀 1.3g
乳糖 5.0g
牛膽鹽 2.0g
氯化鈉 5.0g
（或去氧膽酸鈉） ( 0.5g)
磷酸氫二鉀 4.0g
水 1000ml
除乳糖、牛膽鹽或去氧膽酸鈉外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.4 ±0.2，煮沸，濾清，加人乳糖、牛膽鹽或去氧膽酸鈉，分裝，滅菌。
胨 20.0g
0.04%溴甲酚紫指示液 25ml
乳糖 10.0g
水 l000ml
牛膽鹽 5.0g
除0.04%溴甲酚紫指示液外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.4 ±0.2，加人0.04%溴甲酚紫指示液，根據(jù)要求的用量分裝于含倒管的試管中。滅菌。所用倒管的規(guī)格應(yīng)保證產(chǎn)氣結(jié)果的觀察。
營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 100ml
曙紅鈉指示液 2ml
20%乳糖溶液 5ml
亞甲藍(lán)指示液 1.3～1.6ml
取營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，加熱溶化后，冷至60℃，按無菌操作加入滅菌的其他3種溶液，搖勻，傾注平皿。
7.麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（MacC）
胨20.0g
1%中性紅指示液 3ml
乳糖 10.0g
瓊脂 14.0g
牛膽鹽 5.0g
水 l000ml
氯化鈉 5.0g
除乳糖、1%中性紅指示液、牛膽鹽及瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.2 ±0.2，加入瓊脂，加熱溶化后，再加入其余各成分，搖勻，分裝，滅菌，冷至約60℃，傾注平皿。
8.4 -甲基傘形酮葡糖昔酸（4-methylumbelliferyl-β-D-glucuionide，MUG）培養(yǎng)基
胨 10.0g
磷酸二氫鉀（無水） 0.9g
硫酸錳 0.5mg
磷酸氫二鈉（無水） 6.2g
硫酸鋅 0.5mg
亞硫酸鈉 40mg
硫酸鎂 0.1g
去氧膽酸鈉 1.0g
氯化鈉 5.0g
MUG 75mg
氯化鈣 50mg
水 l000ml
除MUG外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.3±0.1，加人MUG，溶解，每管分裝5ml，滅菌。
9.三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基（TSI )
胨 20.0g
牛肉浸出粉 5.0g
乳糖 10.0g
蔗糖 10.0g
葡萄糖 1.0g
氯化鈉 5.0g
硫酸亞鐵 0.2g
硫代硫酸鈉 0.2g
0.2%酚磺酞指示液 12.5ml
瓊脂 12.0g
水 1000ml
除三種糖、0.2%酚磺酞指示液、瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.3±0.1,加入瓊脂，加熱溶化后，再加入其余各成分，搖勻，分裝，滅菌，制成高底層（2～75px）短斜面。
胨 5.0g
硫代硫酸鈉 30.0g
牛膽鹽 1.0g
水 l000ml
碳酸鈣 10.0g
取上述成分，混合，微溫溶解，滅菌。
臨用前，取上述培養(yǎng)基，每10ml加入碘試液0.2ml和亮綠試液0.lml，混勻。
胨 5.0g
硫代硫酸鈉 8.5g
牛肉浸出粉 5.0g
中性紅指示液 2.5ml
乳糖 10.0g
亮綠試液 0.33ml
牛膽鹽 8.5g
瓊脂 16.0g
枸櫞酸鈉 8.5g
水 1000ml
枸櫞酸鐵銨 1.0g
除乳糖、中性紅指示液、瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.2±0.1,濾過，加入瓊脂，加熱溶化后，再加入其余各成分，搖勻，滅菌，冷至60℃，傾注平皿。
12．膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基（DHL )
胨 20.0g
枸櫞酸鈉 1.0g
牛肉浸出粉 3.0g
枸櫞酸鐵銨 1.0g
乳糖 10.0g
中性紅指示液 3ml
蔗糖 10.0g
瓊脂 16.0g
去氧膽酸鈉 1.0g
水 l000ml
硫代硫酸鈉 2.3g
除糖、指示液及瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.2±0.1,加入瓊脂，加熱溶化后，再加人其余成分，搖勻，冷至60 ℃，傾注平皿。
13.溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基
胨 10.0g
溴化十六烷基三甲銨 0.3g
牛肉浸出粉 3.0g
瓊脂 14.0g
氯化鈉 5.0g
水 l000ml
除瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.5±0.1，加入瓊脂，加熱溶化后，分裝，滅菌，冷至60 ℃，傾注平皿。
14．亞碲酸鹽肉湯培養(yǎng)基
臨用前，取滅菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，每100ml中加人新配制的1%亞諦酸鈉（鉀）試液0.2ml，混勻，即得。
15．卵黃氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基
胨 6.0g
10%氯化鈉卵黃液 100ml
牛肉浸出粉 1.8g
瓊脂 14.0g
氯化鈉 30.0g
水 650ml
除10 %氯化鈉卵黃液外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.6土0 .1，滅菌，待冷至約60 ℃，以無菌操作加入10%氯化鈉卵黃液，充分振搖，傾注平皿。
10%氯化鈉卵黃液的制備取新鮮雞蛋1個(gè)，以無菌操作取出卵黃，放入10%無菌氯化鈉溶液100ml中，充分振搖，即得。
胨 10.0g
酚磺酞指示液 2.5ml
牛肉浸出粉 1.0g
瓊脂 14.0g
甘露醇 10.0g
水 l000ml
氯化鈉 75.0g
除甘露醇、酚磺酞指示液及瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)州值使滅菌后為7.4 ±0.2，加入瓊脂，加熱溶化后，濾過，分裝，滅菌，冷至60 ℃，傾注平皿。
胨 20.0g
乳糖 10.0g
0.04%溴甲酚紫指示液 25ml
水 l000ml
除0.04%溴甲酚紫指示液外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.2±0.2，加入指示液，分裝于含倒管的小試管中，每管3ml．滅菌。
18．綠膿菌素（Pyocyanin）測(cè)定用培養(yǎng)基（PDP瓊脂培養(yǎng)基）
胨 20.0g
甘油 l0ml
氯化鎂（無水） 1.4g
瓊脂 14.0g
硫酸鉀（無水） 10.0g
水 1000ml
取胨、氯化鎂、硫酸鉀和水混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.3±0.1，加入甘油及瓊脂，加熱溶化，混勻，分裝于試管，滅菌，置成斜面。
19.梭菌增菌培養(yǎng)基
牛肉浸出粉 10.0g
鹽酸半胱氨酸 0.5g
胨 10.0g
氯化鈉 5.0g
酵母浸出粉 3.0g
醋酸鈉 3.0g
可溶性淀粉 1.0g
瓊脂 0.5g
葡萄糖 5.0g
水 1000ml
取上述成分，混合，加熱煮沸使溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為6.8士0.2，加熱溶化，濾過，分裝，滅菌。
20.哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基
肉胃酶消化物 5.0g
心胰酶消化物 3.0g
酵母浸出粉 5.0g
玉米淀粉 1.0g
氯化鈉 5.0g
瓊脂 15.0g
水 1000ml
除瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.3士0.2，加入瓊脂，加熱溶化，濾過，分裝，滅菌，冷至45～50 ℃，加人相當(dāng)于20mg慶大霉素的無菌硫酸慶大霉素，混勻，傾注平皿。
21．沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基
胨 10g
葡萄糖 40g
水 1000ml
除葡萄糖外，取上述成分，混合，微溫溶解，濾過。加人葡萄糖，溶解，分裝，滅菌。
22．沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基
胨 10g
水 1000ml
葡萄糖 40g
瓊脂 14g
除瓊脂和葡萄糖外，混合，微溫溶解，濾過。加入瓊脂和葡萄糖，溶解，分裝，滅菌。
23.（科瑪嘉）念珠菌顯色培養(yǎng)基（注1）
胨 10.2g
瓊脂 15g
氫罌素 0.5g
滅菌水 1000ml
色素 22.0g
除瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH值至6.3士0.2。濾過，加入瓊脂，加熱煮沸，不斷攪拌至瓊脂完全溶解，傾注平皿。
24.1%聚山梨酯80-玉米瓊脂培養(yǎng)基
黃色玉米粉 40g
瓊脂 10～15g
聚山梨酯80 10ml
水 1000ml
取玉米粉、聚山梨酯80及蒸餾水500ml，混合，65℃加熱30分鐘，混勻，用紗布濾過，補(bǔ)足原水量。取瓊脂，水500ml，混合，加熱溶解。將以上兩種溶液混合，搖勻，分裝，滅菌。
微生物限度
非無菌藥品的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)是基于藥品的給藥途徑及對(duì)患者健康潛在的危害而制訂的。藥品的生產(chǎn)、貯存、銷售過程中的檢驗(yàn)，原料及輔料的檢驗(yàn)，新藥標(biāo)準(zhǔn)制訂，進(jìn)口藥品標(biāo)準(zhǔn)復(fù)核，考察藥品質(zhì)量及仲裁等，除另有規(guī)定外，其微生物限度均以本標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)。
制劑通則品種
制劑通則、品種項(xiàng)下要求無菌的制劑及標(biāo)示無菌的制劑應(yīng)符合無菌檢查法規(guī)定。
口服給藥制劑
細(xì)菌數(shù)每1g不得過l000cfu。每lml不得過100cfu。
霉菌和酵母菌數(shù)每lg或lml不得過100cfu。
大腸埃希菌每1g或lml不得檢出.
局部給藥制劑
3.1用于手術(shù)、燒傷及嚴(yán)重創(chuàng)傷的局部給藥制劑應(yīng)符合無菌檢查法規(guī)定。
3.2耳、鼻及呼吸道吸入給藥制劑
細(xì)菌數(shù)每1g、lml或l0cm2，不得過100cfu。
霉菌和酵母菌數(shù)每1g、lml或l0cm2，不得過10cfu。
金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌每1g、lml或l0cm2不得檢出。
大腸埃希菌鼻及呼吸道給藥的制劑，每1g、lml或l0cm2，不得檢出。
3.3陰道、尿道給藥制劑
細(xì)菌數(shù)每1g、lml或l0cm2，不得過100cfu。
霉菌數(shù)和酵母菌數(shù)每1g、lml或l0cm2應(yīng)小于10cfu。
金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌每1g、lml或l0cm2，不得檢出。
3 .4直腸給藥制劑
細(xì)菌數(shù)每1g不得過l000cfu。每lml不得過100cfu。
霉菌和酵母菌數(shù)每1g或lml不得過100cfu。
3.5其他局部給藥制劑
細(xì)菌數(shù)每1g、lml或l0cm2不得過100cfu。
霉菌和酵母菌數(shù)每1g、lml或l0cm2不得過100cfu。
金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌每1g、lml或l0cm2不得檢出。
含動(dòng)物組織
含動(dòng)物組織（包括提取物）的口服給藥制劑每10g或10ml還不得檢出沙門菌。
兼用途徑制劑
應(yīng)符合各給藥途徑的標(biāo)準(zhǔn)。
霉變長(zhǎng)螨者
以不合格論。
原料及輔料
參照相應(yīng)制劑的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。
注1：本檢查法中白色念珠菌檢查所描述該菌在念珠菌顯色培養(yǎng)基上的菌落特征，是指該菌在法國(guó)科瑪嘉公司提供的科瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落特征。給出這一信息是為了方便本方法的使用者，并不表示對(duì)該公司產(chǎn)品的認(rèn)可．若其他等效產(chǎn)品具有相同的效果，那么也可使用其他等效的產(chǎn)品。 [1]
以上文中方法中提到的“無菌檢查法（附錄XII A）”為《中國(guó)藥典》2010版二部附錄XII A無菌檢查法。